一、杂散光的重要性
杂散光是紫外可见分光光度计非常重要的关键技术指标。它是紫外可见分光光度计分析误差的主要来源, 它直接限制被分析测试样品浓度的上限。当一台紫外可见分光光度计的杂散光一定时, 被分析的试样浓度越大, 其分析误差就越大。ASTM 认为: “杂散光可能是光谱测量中主要误差的来源。尤其对高浓度的分析测试时, 杂散光更加重要”。有文献报道, 在紫外可见光区的吸收光谱分析中, 若仪器有1%的杂散光, 则对2. 0A 的样品测试时, 会引起2%的分析误差。杂散光对高浓度试样的影响如图4-4 所示。
二、杂散光的定义及理论推导
( 一) 杂散光的定义
目前, 国际上对杂散光的定义各异。下面介绍几种比较简洁的杂散光的定义。
1. ASTM 的定义
美国的ASTM 对杂散光定义是: 杂散光既难给出确切的定义, 又难进行准确的测量。人们常将杂散光定义为在单色器额定通带之外的透射辐射能量与总的透射能量之比。
2. Richa rd 的定义
日本的Richard 等对杂散光的定义是: 杂散光通常定义为假辐射( Spurious Radiation) 和所需要的辐射(Desired Rabiation ) 之比。
3. Winstead 的定义
美国的Winstead 对杂散光的定义是: 如果波长出现与仪器刻度盘(或显示) 上的示值不同, 那么这个外界的能量就叫做杂散光。
4. M. R. Sharpe 的定义
美国的M. R. Sharpe 把杂散光定义为: 光谱带宽以外“ 不要的” 光通量的成分叫杂散光。
上述四者的定义都是对的。但太繁琐, 概念上不容易被人理解。作者认为,应该从概念出发, 从杂散光测试的角度出发, 从便于建立杂散光测量方法的角度出发, 可以更简单的对杂散光下定义为: “不应该有光的地方有光, 这就是杂散光”。这种定义, 便于从概念或定义出发, 直观的建立简单可靠的测试设备。
( 二) 杂散光的理论推导
作者导出了杂散光与吸光度误差和吸光度真值之间关系的理论计算公式。该理论计算公式具有普遍指导意义。
式( 4-19) 表示
① AA (或ΔA) 与S 和A 成对数关系。
② 当A 一定时, 对不同的S 值可计算出造成的AA (或ΔA) 值。
③ 当S 一定时, 不同的A 有不同的AA (或ΔA) 。
作者根据式(4-19) 算出了14 种杂散光下, 吸光度相对误差ΔA/ A 和吸光度真值A 之间的关系(部分数据见表4-1)。绘制了12 条误差曲线( 见图4-5)。这些关系和曲线, 可覆盖目前世界上所有的紫外可见分光光度计, 具有普遍的参考应用价值。
三、杂散光对仪器分析测试误差的影响
杂散光对紫外可见分光光度计分析测试误差的影响可分成两种形式: 第一种形式是杂散光的波长与测试波长相同。它是由于测试波长因为某些原因而偏离正常光路, 在不通过试样的情况下, 直接照射到光电转换器上。这种杂散光大多数是由于光学元件、机械零件的反射和漫射所引起, 可以通过一个对测试波长不透明的样品来检查。当发现放在比色皿中的不透明样品的透射比不为零
图4-5 杂散光S 与吸光度相对误差ΔA/ A0 和吸光度真值A0 的关系
时, 说明仪器中有这种杂散光存在。但必须注意, 当仪器存在零点误差时, 有可能造成混淆。如果在不透明的样品上涂上白色, 则可增加样品本身反射和散射的效果, 可以提高测量灵敏度。第二种形式是指测试波长以外的、偏离正常光路而到达光电转换器的光线。它通常是由光学系统的某些缺陷所引起的。如光学元件的表面被擦伤、仪器的光学系统设计不好、机械零部件加工不良, 使光路位置错移等。
通常情况下所讲的杂散光, 是指包括上述两种杂散光在内的杂散光。假设Is 为杂散光的总和, It 为光电转换器检测到的总能量, 它包括测试波长的能量I 和杂散光的能量Is , 即It = I + Is 。在实际分析测试工作中, 需要知道的是杂散光能量Is 相对于总能量It 的比值。常称之为杂散光的量S = Is/ It 。由于Im Is , 因此, 可以近似的认为It = I , 近而可以认为S = Is/ I。
S = Is/ I 表示当测试波长的能量降低时, 杂散光比例就会相应增加。对紫外可见分光光度计的边缘波长来说, 光源的强度、光电转换器的灵敏度和单色器的透过率都是比较低的, 这时杂散光的影响就会更加明显。所以, 在紫外可见分光光度计中, 应该首先检查200～220nm 处的杂散光。
众所周知, 杂散光对参考光束和样品光束的影响是相同的。因此, 根据比耳定律, 可得到
由此可见, 当样品的透射比为10%时(即吸光度为1 时) , 1%的杂散光,可使其吸光度从1. 000 降到0. 9629。同理, 透射比为10% 时, 0. 1% 的杂散光, 将使吸光度从1. 000 降到0. 996。当杂散光为0. 05% 时, 对吸光度为1. 00 A 的试样进行分析测试, 其结果为0. 998 A, 相对误差为ΔA/ A = 0. 002/ 1 =0. 002 (即0. 2% ) , 基本能满足所有常规分析测试和质检工作的要求。如果杂散光为0. 01% 时, 杂散光对分析测试的结果就基本上没有影响了。目前,国际上许多高档紫外可见分光光度计的杂散光都在0. 01% 以下。从使用者角度讲, 过低的杂散光是没有必要的, 但可惜的是, 我国的高档紫外可见分光光度计中, 还只有北京普析通用公司一家的TU-1901 的杂散光为0. 01% 。其余厂商生产的紫外可见分光光度计, 杂散光都在0. 01% 以上。所以, 我国的紫外可见分光光度计要赶超国际先进水平还需继续努力。
杂散光对分析测试结果的误差影响是随着吸光度值增大而增大的。因此,吸光度值越大, 对误差的影响也越大。如果吸光度A = 3 ( 即T = 0. 001 ) , 则杂散光为1%时, 分析测试的结果将由A = 3 变成A = 1. 963 [ A = - lg(0. 001 +0. 01) + lg1. 01 = 1. 9568 + 0. 0043 = 1. 963 ]。由此可见, 吸光度A = 3 时, 1%的杂散光可使分析测试的结果将由A 从3 降到2 以下。
杂散光的影响, 会使分析测试的结果偏离比耳定律; 当杂散光被试样吸收时, 偏离是正值( 测量值大于真实值)。当杂散光不被试样吸收时, 偏离是负值( 测量值小于真实值)。其差值ΔA 可由下式计算
因为杂散光强度在边缘波段比较大, 所以在波长小于220nm 处测试时,必须认真检查有无“ 假峰” 出现。原来试样随波长变短而吸收值增大, 但是因为杂散光在短波部分急剧增大, 所以使得原来逐渐增大的吸光度值反而变小。
这时, 就会出现如图4-6 所示, 不应有的“假峰”。
杂散光对紫外可见分光光度计分析测试误差的影响, 除了以上所述外, 还可很方便地从图4-5 和表4-2 中查得。因此, 图4-5 和表4-2 是非常有实用价值的。在使用者评价或挑选紫外可见分光光度计时, 只要知道仪器的杂散光, 就可立即从图4-5 和表4-2 上查到该仪器由于杂散光引起的测量误差概况和该仪器能否满足使用要求。例如, 要挑选一种紫外可见分光光度计, 用它来测试某种生物酶, 该生物酶的浓度较高, 吸光度值为1. 95Abs 左右, 而且要求分析测试的误差为1% ; 但有一台紫外可见分光光度计, 其杂散光为0. 2% , 看它能否满足使用要求, 只要从图4-5 和表4-2中一查, 立即就可得知该仪器不能满足使用要求, 因为杂散光为0. 2%时, 若吸光度值为1. 95Abs , 则其测试结果因杂散光而引起的相对误差就达到3. 6% , 再加其他因素引起的误差, 肯定总分析误差大大超过1%。从图4-5 和表4-2 又可立即查到, 该分析测试工作, 必须要求一台杂散光为0. 05% ( 或优于0. 05% ) 的紫外可见分光光度计, 才能满足该项分析工作的要求。
众所周知, 紫外可见分光光度计在制药行业中使用较多。并且各国的药典都明确要求许多药品一定要用紫外可见分光光度计来分析测试。我国的药典规定对人用药品的检测时, 许多药品的相对测试误差都不能超过1%。如假设使用的紫外可见分光光度计的杂散光为0. 5% , 将很快从图4-5 和表4-1 查到,该仪器测量的吸光度上限最多只能是0. 55Abs。如果被检测药品的吸光度大于0. 55Abs , 若为0. 8Ab s , 则测量误差就大于1% , 达到1. 42% , 就不符合我国药典规定的相对误差为1%的要求, 即不合格。由此可见, 不管是制造者还是使用者, 都必须高度重视对仪器杂散光的控制和选择。
从表4-1 和图4-5 可知, 若杂散光为0. 0001% , 则仪器在测量很浓的样品时( 吸光度上限为3. 4Ab s 时) , 杂散光引起的测量相对误差仍可达到0. 032% , 这已远远优于世界各国药典规定的指标(即1%) , 至少优于30 倍以上。尤其是还有些厂商推出的紫外可见分光光度计, 其杂散光达到0. 00008% (Ca ry500、Lambda900 等) 。这么优秀的杂散光, 除能显示厂商的光学设计和加工水平外, 对使用者是没有任何实际意义的。因为该仪器的杂散光达到0. 00008%时, 用它对3. 4Abs 的试样分析测试时, 杂散光引起的测量相对误差为0. 0256%。在实际分析测试工作中, 不可能有这样的样品。因此,从使用者的实际使用情况来看, 没有必要无限降低紫外可见分光光度计的杂散光。在要求较高的分析测试工作中, 紫外可见分光光度计的杂散光应优于0. 05% , 这样可保证仪器有较宽的线性动态范围。即使试样的吸光度在1. 95Abs 的时候, 仍能达到1%的分析测试准确度。目前, 我国生产的紫外可见分光光度计, 普遍存在杂散光大的问题, 除北京普析通用公司的TU-1900、TU-1901 紫外可见分光光度计的杂散光优于0. 01% , 上海分析仪器总厂、北京第二光学仪器厂的个别仪器的杂散光能达到0. 05%左右外, 其他二十多家紫外可见分光光度计的生产厂家生产的仪器都未达到0. 05% 的水平。而且,大多数紫外可见分光光度计的杂散光在0. 1% 左右。因此, 应努力降低国产紫外可见分光光度计的杂散光, 以赶超国际先进水平。
四、杂散光的来源
产生杂散光的原因很多, 其最主要的原因大致有以下9 个方面:
① 灰尘沾污光学元件( 如光栅、棱镜、透镜、反射镜、滤光片等)。
② 光学元件被损伤, 或光学元件产生的其他缺陷( 如光栅、透镜、反射镜、棱镜材料中的气泡等)。
③ 准直系统内部或有关隔板边缘的反射。
④ 光学系统屏蔽不好。
⑤ 热辐射或荧光引起的二次电子发射。
⑥ 狭缝的缺陷。
⑦ 光束孔径不匹配。
⑧ 光学系统的像差。
⑨ 单色器内壁黑化处理不当。
以上9 个方面中, 光栅是杂散光的主要来源。它产生的杂散光占总杂散光的80%以上。
五、杂散光的测试方法和测试材料
( 一) 杂散光的测试方法
目前, 测试杂散光最常用的方法是所谓“ 截止滤光法” ( T he Cut Off FilterMethod) 或称作“ 滤光片法” ( The Filte r Method) 。主要是采用滤光片或滤光液来测试紫外可见分光光度计的杂散光。有时也采用He-Ne 激光器的632. 8nm 来测试杂散光。具体做法是在离632. 8nm±5nm 处进行测试, 测出的数值与632. 8nm 相比就是杂散光。
“截止滤光法” 的具体测试方法: 仪器冷态开机, 预热0. 5h , 如用“滤光片法” 测试, 则参比为空气; 如用滤光液来测试, 则参比为溶剂(若用NaI、NaNO2 水溶液, 则参比为蒸馏水)。设置仪器的纵坐标为% T , 横坐标为波长( nm) , 用滤光液时, 试样比色皿中装滤光液, 参比比色皿中装溶解液, 将波长调到相应的波长上( NaI 为220nm、NaNO2 为340nm) 进行测试。杂散光测试曲线如图4-7 所示。
图4-7 杂散光测试曲线
测试220nm 处的杂散光时, 国际上都是采用10g/ L 的NaI 水溶液。该水溶液的光谱特性为: 0～258 nm 处不透光, 而从258 nm 开始, 透光率可立即达到90%以上, 并且上升坡度很陡。只要将10g/ L 的NaI 水溶液装入比色皿,参比比色皿中装满水, 将仪器的波长调到220nm。因为10g/ L 的NaI 水溶液在0～258nm 处不透光, 故仪器的输出应该为0。但仪器的实际输出不是0 ,即有光信号输出, 这就是220nm 处的杂散光。
测试340nm 处的杂散光时, 国际上都是采用50g/ L 的NaNO2 水溶液。50 g/ L 的NaNO2 水溶液的光谱特性为: 0～385nm 处不透光, 而从385nm 处开始, 透光率可达90% 以上, 并且上升坡度很陡。我们只要将50g/ L 的NaNO2 水溶液装入比色皿, 参比比色皿中装满水, 将仪器的波长调到340nm。此时, 因为50g/ L 的NaNO2 水溶液在0～385nm 处不透光, 故仪器在340 nm处的输出应该为0。但仪器的实际输出不是0 , 即有光信号输出, 这就是340nm处的杂散光。
( 二) 杂散光的测试材料
杂散光的测试材料中, 可分为滤光片和滤光液两种。滤光片又分为带通滤光液和截止滤光片两种。滤光液则有很多种, 如丙酮、NaI、NaBr、KCl(12g/ L) 、NaNO3 等。
美国ASTN 提出的杂散光测试方法中, 规定了多种滤光液( 主要用于紫外、可见光区) 和滤光片( 主要用于红外区) 来作为标准滤光材料。并且,ASTM 方法于1977 年被确定作为美国一种国家标准。W. Slavin 等人曾报道过18 种截止滤光片或滤光液, 可用来测定各类光谱仪器的紫外、可见、近红外区的杂散光。L. Cahn 等人曾用Vycor (Cor ning Silica) 来检测220nm 处的杂散光。Richard 等人曾报道过7 种测试紫外区不同波段杂散光所采用的滤光液。美国Beckman 公司对DU-8B 紫外可见分光光度计的杂散光进行测试时,在220nm、340nm、370nm、680 nm 处, 曾经都采用过ASTM 标准方法。日本岛津公司对UV-3000 和U-250 紫外可见分光光度计的杂散光进行测试时,在340 nm 处都采用UV-39 截止滤光片, 而在220nm 处测试杂散光时, 都采用NaI 滤光液。对UV-365 紫外可见分光光度计的杂散光进行测试时, 在195 nm
处采用UV-25 滤光片在340nm 处则用UV-39 截止滤光片。日本日立对150-20 紫外可见分光光度计的杂散光进行测试时, 在340 nm 处用NaNO2 , 在220nm 处也用NaI 滤光液。
另外, 也偶见国外个别厂商采用测量离中心波长50cm - 1 或几个纳米处的透射光强度与中心波长处透射光强度之比的大小, 来作为衡量光谱仪器杂散光的指标。如法国的J. Y. 公司, 对T-800 激光拉曼光谱仪的杂散光测试就是这样进行的。
目前, 国内已有近30 家企业在生产紫外可见分光光度计, 但除少数企业对220nm、340nm 这两个波长处分别用NaI 和NaNO2 来测试杂散光外, 绝大多数只用NaI 来测220nm 这一点的杂散光。这种作法不妥。还是应测试220nm 和340nm 两个波长的杂散光较好, 因为, 能量是波长的倒数, 220 nm处波长短, 容易产生杂散光。而340 nm 处是氘灯和钨灯的换灯处, 也容易产生杂散光。
作者曾采用带通滤光片ZWB1 、截止滤光片JB6 和NaI 滤光液以及蒽( 溶解在乙醇中) 滤光液等, 分别对原上海光学仪器厂生产的55W 光栅单色仪的220nm、357 nm、436nm 和446nm 等波长处的杂散光进行了测试, 得到了满意的结果。
滤光片和滤光液中, 哪种好呢? Slavin 和Richard 等人曾经作过讨论,Slavin 等认为用溶液能给出真实的杂散光, 用滤光片则可能低估杂散光。Richa rd 等人则认为滤光片有非常广阔的截止区(Broad cut off ) , 而滤光液的截止要比滤光片更加锐利, 并且给出了NaBr 水溶液和Corning Vycor 滤光片
二者相比较的“ 透过率-波长” 关系的实测值, 但Richard 没有明确评论何者好。作者认为对滤光材料的选择或评价其优劣, 不能简单定论, 而应从实际情况出发。因为使用滤光片( 如Vycor ) 虽然操作简单, 但是, 第一, 理想优质的滤光片很难得到。第二, 在进行杂散光测试时, 需要用参考片基( 如SiO2 ) , 而理想的参考片基一般不大容易找到。第三, 滤光片吸收一部分杂散光, 所以, 用它来测试杂散光时, 往往容易低估杂散光。而使用滤光液( 如NaBr 溶液) , 虽说测量结果较准确, 且参考物质H2 O 容易得到, 但标准滤光液也不容易得到。同时, 滤光液还受比色皿的影响。
在波段范围和测试设备相同的情况下, 在图4-8 中测试点C 处的I1 和I0 都较大时, 用滤光片较好。因为,滤光片的透过率小, 吸收一部分杂散光, 但对测量结果的影响较小。而I1和I0 都较弱时, 选用滤光液较好, 因为相对误差小( 滤光液对杂散光的吸收远小于滤光片)。所以, 滤光片和滤光液各有其优缺点, 应酌情选用, 不能一概而论。
六、与杂散光测试有关的几个问题
( 一) 关于测试点位置的选择
关于测试点位置的选择, 即Δλ取多少为好呢? Edisbury 认为, 取Δλ为5～10nm 以外, 会低估杂散光; 若取20nm 处, 则可低估50%。Richard 等人认为, Δλ取值大于光谱带中央有效带宽10 倍为好。如前所述, 国外许多科技工作者和有关厂商, 在测试光谱仪器的杂散光时, 所取的Δλ各不相同。如日本日立公司测试150-20 型紫外可见分光光度计的杂散光时, 在340nm 处用NaNO2 ( 50g/ L ) 水溶液, 但此水溶液在300 ～ 385 nm 的波长范围内, 在385nm 长波处产生的透过率为10 - 4 。假设它为0 ( 即截止) , 故测试150-20 紫外可见分光光度计的杂散光时, 若测试点为340nm, 此时测试点离透光点的Δλ= 385 - 340 = 45nm。测试220nm 处的杂散光时, 则用Na I (10g/ L ) 水溶液, NaI ( 10g/ L) 水溶液的光谱特性为0～ 258nm 处不透光, 所以, 此时测试点离透光点的Δλ= 258 - 220 = 38nm。日本岛津公司测试UV-250 紫外可见分光光度计的220nm 处的杂散光, 美国Varian 公司测试对DMS90 紫外可见分光光
度计220nm 处的杂散光时, 也都用NaI (10g/ L 水溶液) , 同样, 其Δλ= 38nm。大约20 年前, 我国科技工作者在测试紫外可见分光光度计220nm 处的杂散光时, 用NaBr (10g/ L 水溶液)。此水溶液在195～223nm 内, 长波处产生的透过率为10 - 4 , 即在223nm 处的透过率为10 - 4 , 忽略它, 即假设223 nm处的透过率为0 , 故取220nm 时, Δλ= 223 - 220 = 3 nm。因为测试点离透光点的距离短( 仅3nm) , 所以测出的杂散光偏大。综上所述, 目前国内外许多厂商或科技工作者, 在对紫外可见分光光度计
的杂散光测试时, Δλ一般取39～45nm。作者认为, Δλ取20～45nm 较好。
① 若用R456 光电倍增管作为测试装置中的光接收器, 则取20nm 左右时, 测得的杂散光强度或光电流大小, 一般约为1. 0×10 - 8 A 左右; 它既可保证一般光电倍增管( 如R456、R928、1P28 等) 输出的信噪比S/ N 大于或等于2 倍以上, 又可保证光电倍增管工作在线性区。作者在用JB6、ZWB1 等国产滤光片测试55W 光栅单色仪的杂散光时, 取Δλ= 20nm, 杂散光信号的大小为0. 00002V 左右, 再根据所用的光电倍增管(R456) 和整个测试装置的各种参数, 可以很简单的计算出杂散光产生的暗电流为1. 0×10 - 8 A 左右, 光通量为1. 0×10 - 8 lm 左右, 完全可保证光电倍增管工作在线性区。若取Δλ<20 nm, 仍用R456 光电倍增管作为光接收器, 则光电流有可能增大, 甚至有可能使光电倍增管不能工作在线性区。因此, 不能得到满意的结果。
② Δλ取20～45nm 时, 上述滤光片材料的吸收系数一般在4Abs 左右,透过率在10 - 4 左右。在这种情况下测得的杂散光, 一是置信度高; 二是能满足高精度的光谱测试的要求。
③ Richa rd 等人指出: 杂散光一般来自标称波长附近几十个纳米的范围内。所以, 取Δλ= 20～45nm 时, 既有代表性, 又能保证测试结果的可靠性。
( 二) 被测波段及测试点数量的选择度为2850～3300K) 作光源测试可见光区的杂散光。若在可见区用氙灯作光源, 需要用滤光片去掉不需要的光。测试红外区杂散光时, 则用能斯脱( Nernst ) 或白炽灯, 但要注意光源的温度调节。国内也有人用He-Ne 激光器作光源测试紫外可见分光光度计的杂散光。
作者的体会是, 紫外区用氘灯作光源最好。一是氘灯电源不如氙灯复杂,容易制作; 二是氘灯发出的热量比氙灯少, 不需要散热装置; 三是在紫外区氘灯的能量较集中, 一般其光强或能量分布的峰值位置在250～260nm 左右。而可见光区, 则用ASTM 规定的白炽灯较好。但不管是紫外区还是可见区, 都不宜用氙灯作光源。因为氙灯的红外线太强, 会给杂散光的测试工作带来许多麻烦。此外, 不管用哪种光源, 必须注意其供电电源的稳定性( 氘灯用恒流源、钨灯用恒压源)。此外, 选用He-Ne 激光器作光源不太理想, 因为只能测得632. 8nm 附近的杂散光, 不能完全反映整机的杂散光水平, 但它仍有使用价值。
( 四) 关于光电转换器(光接收器) 的选择
测试紫外可见分光光度计的紫外可见区的杂散光时, 国外基本上都采用光电倍增管作光接收器, 红外区则用热电偶、热敏电阻等。作者认为, 在紫外光区、可见光区用光电倍增管R456、R928 作光接收器最好, 在红外区则用真空热电偶或硫化铅( PbS) 最好。但用光电倍增管时, 若用直流法检测光电流时, 则必须扣除光电倍增管的暗电流, 否则, 将暗电流当杂散光计算, 会使测量结果增大一个数量级以上。而用热电元件时, 最好采用交流法来检测光电流, 因为热电元件的噪声一般都很大, 而用交流法时可以基本上消除热噪声对测量的影响。
此外, 在使用光电倍增管时, 还应注意选择光电倍增管的供电电源。必须选用电压稳定度(电压调整率) 优于5×10 - 4 的高压稳压电源供电, 才可保证得到好的测试结果。如在测试55W 光栅单色仪的杂散光时, 开始用电压稳定度(电压调整率) 为4×10 - 3 (实测数据) 的高压稳压电源给R456 供电, 结果, 测出的杂散光达到1. 0×10 - 2 (实际上是因为电源电压不稳, 而导致光电倍增管的放大倍数不稳所致)。后来, 改用自制的优于5×10 - 4 的高压稳压电源给R456 供电, 其他条件都不变, 结果55W 光栅单色仪的杂散光实测值为3×10 - 3